Микроскопия в виноделии
Существуют несколько важнейших задач, которые каждый винодел должен уметь решать с помощью микроскопа.
Во-первых, нужно визуально различать бактерии, дрожжи и грибы под микроскопом.
Во-вторых, выделять живые организмы из общей массы (растительных клеток, кристаллов, осветляющих веществ и т. п.).
В-третьих, нужно научиться идентифицировать наиболее часто встречающиеся микроорганизмы, чтобы найти их, при решении той или иной проблемой.
Со временем вы поймете, что не знаете, что может расти в вине, поэтому вам нужно подготовиться или воспользоваться чужой помощью. В этой статье есть изображения наиболее распространенных дрожжей, бактерий и плесеней, встречающихся в винах. Наконец, вы должны научиться подсчитывать дрожжевые клетки и различать живые и мертвые клетки.
Типы микроскопии
Существует множество видов микроскопов: от простых биологических всего за нескольких тысяч рублей до очень сложных за миллионы рублей.
Обычно виноделы используют биологические микроскопы с объективами хорошего качества, с фазовоконтрастным устройством, которое будет полезно при наблюдении неокрашенных микроорганизмов. Большинство микроскопов имеют окуляры с увеличением 10х и объективы с увеличениями 4х, 10x, 40х и 100x. Это дает вам диапазон увеличения от 40x до 1000x. Также можно установить окуляры другой кратности - 16x или 20x. Для объектива 100x всегда требуется иммерсионное масло, уменьшающее преломления света, проходящего через воздух между образцом и объективом. Это эффективно увеличивает разрешение объектов под микроскопом. 20-кратный окуляр с объективом 40x даст вам общее увеличение 800x без использования масляной иммерсии. Однако разрешение не будет таким высоким. На рисунке ниже показано, как дрожжи сахаромицеты выглядит на разных увеличениях (100x, 400x, 1000x).
В настоящее время на рынке существуют очень недорогие цифровые микроскопы, в комплекте которых есть цифровая камера, подключаемая к вашему ПК. Цифровые микроскопы могут использоваться для тех же целей, что и простые, просто некоторым людям легче смотреть на монитор ПК, чем в окуляры. Кроме того, цифровой зум дает дополнительные возможности увеличения изображения, однако, следует помнить, что это может привести к “пикселизации” картинки.
Как и в случае с любым микроскопом, качество оптики определяет качество изображения. Лучшие оптические микроскопы имеют третий оптический порт для крепления цифровой камеры. Это позволяет просматривать изображения на экране компьютера. Использование цифровой камеры позволяет легко обмениваться изображениями с коллегами, а некоторые пользователи считают экран более простым в использовании, чем традиционный окуляр.
Существуют также различные типы микроскопии для конкретных целей. Наиболее знакомо вам, вероятно, светлое поле, при котором для освещения объекта используется свет, поглощаемый в более плотных областях, что обеспечивает контрастность изображения. Темное поле исключает не рассеянный свет, оставляя темный фон и объект в поле зрения. Флуоресцентная микроскопия использует блоки фильтров для создания требуемого изображения. Первый фильтр служит для освещения поля зрения светом определенной длины волны. Второй фильтр отсекает эту длину волны, но позволяет свету, изучаемому возбужденной молекулой объекта исследования, проходить через окуляр и визуализироваться. Многие биологические образцы, особенно фотосинтетические, обладают значительной естественной флуоресценцией, но чаще образцы окрашиваются или маркируются флуоресцентными красителями или этикетками, что позволяет наблюдать структуры или конкретные соединения в клетках. Микроскопия фазового контраста и дифференциального интерференционного контраста (ДИК) - это методы, которые используются для улучшения четкости изображения объектов с низкой контрастностью. Использование фазового контраста или ДИК-микроскопа для исследования бактерий позволяет неопытным пользователям наблюдать мелкие и малоконтрастные микроорганизмы. В фазово-контрастной микроскопии фазовые сдвиги, не различаемые человеческим глазом, преобразуются в амплитудные, которые вы можете наблюдать. ДИК работает аналогичным образом, но использует интерферометрию, а не фазовые сдвиги, чтобы визуализировать невидимые структуры в клетках. Фазовый контраст является более распространенным и менее дорогостоящим, чем ДИК, но визуализированные ДИК-образцы имеют меньше светлых ореолов, чем образцы в фазовом контрасте. Ниже приведены фотографии молочнокислых кокковидных бактерий рода Oenococcus в светлом поле при 400x, в фазовом контрасте и ДИК при 1000x.
Дифференциация дрожжей, бактерий и плесеней
Самый простой способ дифференцировать бактерии, дрожжи (одноклеточные грибы) и плесени (нитчатые грибы), как правило, по размеру. Плесени хорошо видны при 100-кратном увеличении, дрожжи - при увеличении в 400 крат, а бактерии - при 1000-кратном увеличении. Однако сравнение размеров этих организмов может быть затруднено без эталона. Проще определить, если вы смешиваете культуры на одном стекле или если они уже смешаны в образце ферментации. Но в виноделии есть несколько часто встречающихся микроорганизмов, которые не так легко различить. Ниже приведена смесь обычной почвенной бактерий капустная палочка и лактобацилл из образца вина. Капустная палочка является наиболее распространенной не винной бактерией, и это очень большая бактерия.
В то время как большинство бактерий намного меньше дрожжей, капустная палочка является очень крупной бактерией. На изображении ниже капустная палочка показана в сравнении с обычными пекарскими дрожжами. Несмотря на то, что размеры сходны, бактерии хуже преломляют свет, более прозрачные и трудно различимые. Это, в целом, характерно для бактерий и дрожжей. Второе изображение представляет собой дрожжи сахаромицеты, которые размножаются делением, а не почкованием. Поскольку бактерии также размножаются делением, большую бактерию, такую ??как капустная палочка, можно было бы принять за размножающиеся дрожжи. В приведенном ниже примере оба изображения имеют одинаковое увеличение, и вы можете видеть, что капустная палочка меньше дрожжей.
Дрожжи также меньше плесеней, которые имеют нитевидную структуру, тогда как дрожжи являются одиночными клетками. Обычно это позволяет легко отличить их друг от друга, но есть исключения. Самое главное в винной среде - дрожжи, такие как бреттаномицеты, которые образуют псевдогифы. Ниже приведено прямое сравнение псевдогиф бреттаномицетов и гиф плесени ботритис серый. Первое изображение - бреттаномицет при 1000-кратном увеличением, а второе - ботритис серый при 100-кратном увеличением. ботритис серый примерно в 10 раз больше, чем бреттаномицеты.
Другой пример, когда трудно определить, видите ли вы дрожжи или плесени - образование плесенью спор. В этом случае вы можете наблюдать отдельные споры. Ниже приведены фотографии дрожжей и споры плесени для сравнения.
Подсчет живых и неживых дрожжей
Микроскоп и несколько простых инструментов можно использовать, чтобы получить представление о количестве в суспензии сахаромицетов клеток вообще и живых в частности. Для определения количества клеток в данном объеме жидкости можно взять обычную камеру Горяева, а краситель метиленовый синий использовать для определения процента живых клеток.
Размеры малых делений клетки сетки камеры Горяева составляют 0.05 мм, а больших — 0.2 мм. При этом сетка нанесена на площадку, расположенную на 0.1 мм ниже, чем две соседние площадки. Эти площадки служат для притирания покровного стекла. В результате объем жидкости над квадратом, образованным большими делениями сетки камеры Горяева, составляет 0.004 микролитра.
Подсчитав количество клеток над большим квадратом, можно подсчитать плотность данного типа клеток в суспензии по формуле:
Количество клеток/мл = количество клеток над большим квадратом х 2.5 х 10^5
Краситель метиленовый синий используется для определения процента живых клеток в вашей суспензии. Вы можете купить раствор метиленового синего с требуемой концентрацией, чтобы легко делать подсчеты. Подготовьте препарат с 5 мкл красителя и 5 мл вашего раствора. В 100 клетках подсчитывают, сколько синих и сколько прозрачных. Синие клетки являются мертвыми, они не могут откачивать краситель после проникновения в клеточную стенку, а прозрачные клетки живые. Время, в течение которого клетки находятся в красителе, очень важно. Попробуйте подсчитать клетки примерно через 5 минут после смешивания красителя и клеточной суспензии. Если вы начнете считать раньше, то краска может попасть не во все ячейки. Если же вы будете ждать слишком долго, некоторые клетки могут перестать откачивать краситель и умрут. На приведенном ниже изображении показано одна и та же область наблюдения через 2, 5 и 10 минут.
Отличие живых клеток от посторонних вкраплений
Самым важным в определении того, что является клеткой, а что нет, является симметрия. Посторонние элементы имеют асимметричный характер, а живые клетки симметричны. Однако есть вещи, которые выглядят симметричными под микроскопом, но не являются живыми (пузырьки воздуха, кристаллы и мертвые клетки). Кристаллы легко идентифицируются по их геометрической форме и острым углам. Пузырьки отличить сложнее, поскольку они округлены, но им не хватает внутренней структуры и они могут быть любого размера. Они также имеют тенденцию расти, когда препарат высыхает. Мертвые клетки очень сложно, а порой и невозможно, отличить от живых. Большая часть остатков мусора является растительными клетками, содержит клетки, соединенные вместе, но оборванные по краям. Другие частицы, которые вы увидите, могут быть занесены в вино, например, с осветляющими веществами.
Некоторое из вышеперечисленного может быть принято за живые клетки. Например, окаменелые диатомовые водоросли, которые образуют горную муку - кизельгур (DE). Ниже приведены фотографии неживых веществ, которые вы можете увидеть в ферментах и вине.
